尊龙凯时细胞凋亡检测：Annexin V/PI法解析

细胞凋亡过程中常伴随着显著的形态变化。早期凋亡时，质膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS）会翻转至细胞质膜表面，而在凋亡的中后期，由于细胞膜通透性的增加，较大分子化合物如碘化丙啶（PI）能够自由扩散进入细胞，使细胞核呈现红色荧光。

AnnexinV是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白，能够高亲和力结合PS。完整的细胞膜对AnnexinV不透过，而早期凋亡细胞的膜状态完好，对PI有拒染性。然而在凋亡中后期及死亡细胞中，PI可以透过细胞膜并使细胞核被染色。因此，联合使用AnnexinV与PI，可以有效区分早期凋亡细胞与其他细胞。

[名称] 流式凋亡检测试剂盒

[货号] AC12L033

[规格] 100T

1. 空白管：将诱导凋亡的细胞不加染料，用于调节电压。

2. 单染管：分别设置只加PI和荧光标记的AnnexinV的单染管，用于调节补偿。

3. 实验管：将诱导凋亡的细胞与所有实验荧光染料混合。

4. 阴性管：正常培养细胞加入染料，确认细胞处于正常状态，以排除假阳性结果。

1. 进行细胞凋亡刺激后，离心5分钟，弃去上清液，收集细胞后用PBS轻轻重悬并计数。

2. 取1~5×10⁵重悬的细胞，离心5分钟，弃上清，添加500µl结合液重悬细胞。

3. 添加5µl的AnnexinV-FITC，轻轻混匀；再加入5μL碘化丙啶，并轻轻混匀。

4. 在室温避光条件下孵育10分钟，可以使用铝箔遮盖以避免光照。

5. 随即进行流式细胞仪检测，其中AnnexinV-FITC显示为绿色荧光，PI显示为红色荧光。

1. 吸出细胞培养液至适当离心管中，用PBS洗涤贴壁细胞一次，再用胰酶消化细胞（最好不含EDTA）。

2. 在细胞消化后的步骤与悬浮细胞的操作步骤相同。

染色孵育完成后，应立即进行流式细胞仪检测或荧光显微镜检测。

• 在检测贴壁细胞时，如果难以控制消化时间，建议使用Accutase细胞消化液，这样对细胞损伤较小，且不会改变细胞膜上PS的分布。

• 选择Annexin-V的荧光染料时，要考虑到细胞的自发荧光，尤其是培养时间较长或药物处理的细胞。必须关注细胞代谢物或药物本身的荧光。通常，细胞代谢物的自发荧光会干扰FITC/PE，因此可以考虑使用Annexin-VAPC。也要检查药物的发射光谱是否会影响选择的染料。

• 染色完成后禁止固定，尽快进行检测。可以将检测管放置于冰上，以减少外部环境对结果的干扰。

• 在进行凋亡的统计时，通常只统计早期凋亡细胞，因为仅有早期凋亡才具参考意义。当然，也有文献会统计总的凋亡比例（包括早期和晚期凋亡），但单纯统计晚期凋亡的比例意义不大。