### 培养条件

培养条件气相：95%空气+5%二氧化碳；温度设定为37℃。

#### 传代方法

首次传代推荐比例为1:2，每2天更换培养液。建议同时购买尊龙凯时的全系列产品，享受超值优惠。

收到细胞后，处理并培养至良好状态，再灌满完全培养液并封好瓶口，这是运输细胞的最佳方法。

#### 细胞处理

在收到细胞后，使用75%酒精喷洒整个细胞瓶进行消毒，随后将其置于超净台内进行严格的无菌操作。将细胞瓶放入37℃、5% CO2的培养箱中静置3-4小时，以稳定细胞状态后再进行后续处理。

使用显微镜观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数的拍照保存（建议40x、100x、200x各一张）。前三天的照片是重要的售后依据，若未提供照片，默认收到的细胞状态良好。

### 细胞培养步骤

#### a、细胞传代

如果细胞未超过80%汇合度，将瓶装的完全培养液收集至离心管中，留5ml的完全培养基，放入37℃、5% CO2孵箱中培养；若细胞密度超过80%，则可进行传代培养。对于贴壁细胞的传代步骤如下：

1. 弃去培养上清，使用不含钙、镁离子的PBS洗涤细胞1-2次。
2. 添加约1-2ml 0.25%胰蛋白酶消化液至培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，观察细胞消化情况。若细胞大部分变圆并脱落，迅速取回操作台，轻轻敲打培养瓶，加入超过5ml的完全培养基以终止消化。
3. 轻轻吹打细胞，使其完全脱落后吸出，转移至15ml离心管中，并在1000RPM条件下离心5分钟。弃去上清液，补加1-2ml的完全培养基重悬。
4. 将细胞悬液按1:2的比例分瓶（两个T25瓶），补充新的完全培养基至每瓶5-8ml，最后放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。

#### b、细胞冻存

1. 当细胞生长至覆盖培养瓶的80%时，弃去T25培养瓶中的培养液，使用PBS清洗细胞一次。
2. 加入约1ml 0.25%胰蛋白酶消化液，观察与转化，待细胞回缩变圆后加入5ml完全培养液停止消化，轻轻吹打使之脱落，转移至15ml离心管中并在1000RPM下离心5分钟。
3. 弃去上清，沉淀细胞后加入1ml尊龙凯时无血清冻存液（货号：C7001），混匀后移入冻存管。
4. 将冻存细胞直放至-80℃冰箱中，如后需要转入液氮罐，需在-80℃冰箱中存放24小时以上再转入液氮罐中。

#### c、细胞复苏

1. 从液氮中取出细胞冻存管（注意佩戴防护面具），快速置入37℃水浴中解冻，直至冻存管中无结晶后，用75%酒精消毒冻存管外壁。
2. 将冻存管中的细胞移至含有5ml完全培养基的15ml离心管中，1000RPM离心5分钟。
3. 弃去上清，使用5ml完全培养基重悬细胞，接种至T25培养瓶，并放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中继续培养。
4. 翌日，换用新鲜完全培养基继续培养。

### 注意事项

某些细胞不易贴附，在运输过程中可能出现细胞脱落，这是正常现象。如脱离的细胞较多，可以将培养瓶内所有培养液收集至离心管中，在1000RPM下离心5分钟，收集上清进行过渡培养。沉淀细胞后添加1-2ml胰酶，轻轻吹打重悬，消化1-2分钟后，再加入5ml完全培养基结束消化。随后再离心，弃去上清，补加1-2ml完全培养基重悬，按1:2比例进行分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml每瓶，最后放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。